牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)是结核分枝杆菌复合群的成员之一，同结核分枝杆菌有99%以上的遗传一致性[1]。M. bovis宿主平日，可感染东说念主类、多样牲畜、非东说念主灵长类动物及野天真物等[2]。东说念主类通过采食未经消毒的乳成品或气溶胶感染M. bovis插入系列，其严重要挟东说念主类健康，也给巨匠衍生业酿成要害的经济耗损，是巨匠杀青隐没结核病经营的阻拦[3]。

M. bovis通过松懈宿主保护性免疫响应合手续存在于宿主的单核吞吃细胞中，至极是巨噬细胞。巨噬细胞是宿主断根M. bovis的主要效应细胞，是高度可塑性的，在机体先天性和获取性免疫轻率中阐述要紧作用[4]。巨噬细胞极化指巨噬细胞被病原微生物、炎症响应、细胞因子或一些理化因素刺激后，字据对多样刺激的不同响应，主要分化为经典活化的M1型(classical activated macrophage， M1型)和聘任性活化的M2型(alternative activated macrophage， M2型)[5-6]。在侵略素-γ (interferon-γ， IFN-γ)和脂多糖的刺激下，巨噬细胞从开动景色可分化为M1型巨噬细胞，促进Th1型免疫轻率，分泌宽广的促炎因子和趋化因子，具有很强的杀菌身手；而白介素-4 (interleukin-4， IL-4)和白介素-13 (interleukin-13， IL-13)提示的M2型巨噬细胞大致产生极少的炎症细胞因子，如白介素-10 (interleukin-10， IL-10)和白介素-12 (interleukin-12， IL-12)，参与组织重塑和建造，并发扬出低的抗原提呈身手[7]。频年来，好多探讨标明巨噬细胞极化在炎症、肿瘤、组织建造和代谢等病理生理历程中阐述着至关要紧的作用[8-9]。现存的对于巨噬细胞极化的探讨也曾详情了一些与M1极化干系的分子和信号通路。有探讨标明，减毒结核分枝杆菌菌株H37Ra感染骨髓起首巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages， BMDMs)和RAW264.7细胞后，M1干系分子的抒发量升高，M1极化巨噬细胞的内质网(endoplasmic reticulum， ER)应激显耀增多，有用去除了细胞内结核分枝杆菌[10]。M. bovis感染的急性炎症响应中，巨噬细胞大致在分枝杆菌产生的IFN-γ的作用下极化为M1型，阐述显耀的抗菌作用[11]。在结核分枝杆菌感染期间，上调KLF4和CREB-C/EBPβ促进巨噬细胞向M2型极化，成心于巨噬细胞中结核分枝杆菌的存活[12]。M1、M2型巨噬细胞的极化在M. bovis感染中的作用也受到越来越多的关爱[13]。

鸟苷酸聚积卵白(guanylate binding proteins， GBPs)是一大类侵略素提示的GTPase眷属[14]，在抗病毒和细菌感染方面具有要紧作用[15-16]。鸟苷酸聚积卵白5 (guanylate-binding protein 5， GBP5)属于GTPase眷属，主要由侵略素-γ提示，参与炎症小体激活及多种病原微生物的细胞先天免疫轻率历程[17]，在介导细胞自主留心细胞内病原体等方面具有要紧作用[18]。有文件报说念，GBP5促进NLRP3-ASC拼装到活细菌过甚细胞壁因素以激活caspase-1切割和IL-1β/IL-18分泌[19]。在流产布鲁氏菌感染历程中，GBP5介导caspase-11激活，促进Gasdermin-D (GSDMD)依赖性细胞焦一火，从而阻拦流产布鲁氏菌感染[20]。GBP5通过提示弗朗西斯菌DNA开释促进AIM2炎症小体的活化[21]。GBP5通过激活calpain/caspase-12/caspase-3和TNF-α/caspase-8/caspase-3信号通路提示肝细胞凋一火并进一步提示肝损害和炎症响应[22]。这些探讨标明，GBP5在细菌感染中具有要紧的周折功能，但GBP5在牛分枝杆菌感染历程中阐述的作用尚不明晰。

本探讨通过siRNA侵略GBP5抒发后探究其对M. bovis感染后巨噬细胞极化的影响，并初次探讨GBP5对信号转导及转录激活卵白3 (signal transducer and activator of transcription 3， STAT3)转录因子的调控作用，以期为牛结核病的防治提供新念念路。

1 材料与体式 1.1 材料

牛分枝杆菌购自中国兽医药品监察所，在含有0.05%吐温-80和10%白卵白-葡萄糖-过氧化氢酶添加剂的Middlebrook 7H9 Broth培养基中培养。在37 ℃培养箱中合手续助长2−3周全对数助长中期。小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7细胞系和乳仓鼠肾细胞BHK21细胞系由本推行室保存。4−6周龄雌性C57BL/6小鼠购买于扬州大学推手脚物中心。置于江苏省疾病留心扬弃中心三级推行室中饲养，温度为20−22 ℃，湿度为45%−50%，解放饮食。动物推行通过南京农业大学推手脚物伦理审查委员会(PTA2019024)审批，适当动物伦理和福利条件。

DMEM培养基、胎牛血清、PBS，Gibco公司；Middlebrook 7H9 Broth、MiddleBrook 7H10琼脂，BD公司；GBP5、提示型-氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase， iNOS)抗体，Proteintech公司；GAPDH、α-tubulin抗体，爱必信(上海)生物科技有限公司；Arg1、TNF-α、Mrc1、STAT3、P-STAT3抗体，Cell Signaling Technology公司；jetPRIME，南京福麦斯生物科技有限公司；双荧光素酶敷陈基因检测试剂盒、BCA卵白定量试剂盒、RIPA裂解液、PMSF和ROS检测试剂盒、N-乙酰半胱氨酸抗氧化剂，上海碧云天生物技巧有限公司；SYBR Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)，TaKaRa公司；ECL试剂，上海天能科技有限公司；CD86 (B7-2) Monoclonal Antibody (GL1)， PE和CD206 (MMR) Monoclonal Antibody (MR6F3)， APC，invitrogen公司；E.Z.N.A Total RNA Kit I，Omega公司。及时荧光定量仪，Thermo Fisher公司；多功能酶标仪，Tecan公司；凝胶成像系统，上海天能科技有限公司；流式细胞仪，BD biosciences公司。

1.2 动物模子的树立

参考文件[23]构建体内模子。将200 CFU的M. bovis重悬于50 μL PBS中，然后将50 μL PBS或50 μL M. bovis菌悬液分手滴加到雌性C57BL/6小鼠两侧鼻腔中，分红2组，每组10只小鼠，待其全皆吸入后，按每笼5只，置于江苏省疾病留心扬弃中心三级推行室饲养，温度为20−22 ℃，湿度为45%−50%，解放饮食，合手续感染6周后正法小鼠，摘取脾脏和肺脏进行后续推行。

1.3 联想siRNA

通过上海吉玛公司构建3条GBP5 siRNA，见表 1。通过RT-qPCR和Western blotting考据侵略遵守，聘任侵略遵守最高的siRNA用于后续推行。

1.4 细胞转染

按照1×106个/孔将RAW264.7细胞接种在6孔细胞板中，待助长至70%−80%后，按照阐发书，应用jetPRIME转染试剂将GBP5的小侵略RNA (siGBP5-186、siGBP5-787和siGBP5-1029)和空缺对照组(siCon)分手转染到细胞中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养36 h。

1.5 缱绻细菌CFU

取助长对数期的RAW264.7细胞，以1×106个/孔接种到6孔细胞板中，培养细胞至80%时，转染siCon和siGBP5 36 h后，以MOI=10的M. bovis分手感染6、12、24和48 h后，弃掉上清，PBS清洗3次，加入100 μL无菌水，室温扬弃10 min，充分裂解细胞并奏乐混匀后，10 000×g离心10 min，取上清。将上清稀释100倍后，取50 μL涂布在7H10固体培养基上，在37 ℃培养箱中培养3−4周后，缱绻细菌CFU。

1.6 RT-qPCR

取助长对数期的RAW264.7细胞，以1×106个/孔接种到6孔细胞板中，培养细胞至80%时，将细胞分为siCon组、siGBP5组、siCon+M. bovis组、siGBP5+M. bovis组，转染36 h后，M. bovis (MOI=10)感染24 h后弃去培养液汇注细胞，PBS清洗3次。字据阐发书，使用E.Z.N.A Total RNA Kit I索求细胞总RNA。使用多功能酶标仪测定RNA的浓度和纯度。使用Step One Plus Real-Time PCR system和SYBR Premix Ex Taq TM进行RT-qPCR扩增。临了汲取2–△△CT法缱绻GBP5、IL-1β、IL-6、TNF-α、Mrc1、Fizz1、CD86、Arg1和iNOS的相对抒发水平，使用引物联想软件Primer 7.0联想特异性荧光定量PCR引物，引物由南京擎科生物技巧就业有限公司合成(表 2)。

1.7 Western blotting

取助长对数期的RAW264.7细胞，以1×106个/孔接种到6孔细胞板中，培养细胞至80%时，将细胞分为siCon组、siGBP5组、siCon+M. bovis组和siGBP5+M. bovis组。转染细胞36 h后，M. bovis感染24 h，弃去培养液汇注细胞，PBS清洗3次，将RIPA裂解液和10 µmol/L的PMSF按100:1配制后，在冰上裂解细胞样品。索求样品后静置10 min，以15 000×g离心10 min取上清。使用BCA卵白定量试剂盒进行卵白质定量。加入5×的SDS-PAGE卵白上样缓冲液，100 ℃水浴10 min。以每个样本40 μg卵白量进行SDS-PAGE电泳，将电泳完了的卵白样本周折至PVDF膜上，在5%脱脂奶粉中室温阻塞2 h，在稀释好的Mrc1 (1:500)、GBP5 (1:1 000)、iNOS (1:500)、GAPDH (1:2 000)一抗中于4 ℃孵育过夜。随后TBST洗3次，在二抗(1:5 000)中室温孵育1 h，TBST洗3次后使用ECL试剂显影并通过凝胶成像系统拍照分析，临了汲取Image J软件分析卵白灰度值。

1.8 免疫组化

将感染200 CFU的M. bovis或PBS处置6周后的小鼠脱颈正法后，在超净台无菌分离小鼠的脾组织，将1/3脾脏固定包埋后进行免疫组化染色。通盘样品均按照阐发书处置，GBP5一抗(1:2 000) 4 ℃孵育过夜，二抗(1:1 000)孵育30 min，DAB显色、脱水、封片。GBP5卵白阳性发扬为胞质内出现棕黄色颗粒。

1.9 流式细胞术

取助长对数期的RAW264.7细胞，以1×106个/孔接种到6孔细胞板中，培养细胞至80%时，将细胞分为siCon组、siGBP5组、siCon+M. bovis组、siGBP5+M. bovis组。转染细胞36 h，M. bovis感染24 h后汇注各组的细胞。用PBS清洗1次后，使用4%多聚甲醛固定10 min，避光孵育流式抗体APC-CD206和PE-CD86，使用流式细胞仪检测各组细胞CD86和CD206的抒发水平，每组细胞竖立3个复孔。

1.10 活性氧(reactiue oxygen species， ROS)检测

取助长对数期的RAW264.7细胞，以1×106个/孔接种到6孔细胞板中，培养细胞至70%−80%时，将细胞分为siCon组、siGBP5组、siCon+M. bovis组、siGBP5+M. bovis组。转染细胞36 h，M. bovis分手感染6 h和24 h后，按照ROS检测试剂盒的使用阐发处置细胞后，多功能酶标仪引发波长为488 nm，辐射波长为525 nm，缱绻ROS开释水平。

1.11 双荧光素酶敷陈基因推行

取助长对数期的BHK21细胞，以1×106个/孔接种在6孔细胞板中，助长至70%−80%后，按以下分组：(1) 空缺组：mock；(2) 对照组：pSTAT3- TA-luc+pRL-TK；(3) 推行组：pSTAT3-TA-luc+ pRL-TK+siCon和pSTAT3-TA-luc+pRL-TK+ siGBP5进行推行，在使用JetPRIME转染试剂与siCon、siGBP5、pSTAT3-TA-luc和pRL-TK共转染36 h后汇注细胞。按照双荧光素酶敷陈基因检测试剂盒的阐发，使用双荧光素酶/海肾测定系统测定敷陈基因的活性，海肾荧光素酶抒发质粒pRL-TK用作里靠近照以轨范化转染遵守。闭幕暗示为相对荧光素酶活性。

1.12 统计学处置

统计数据使用平均值±轨范差(X±SD)暗示。汲取GraphPad Prism 9.0.0作图，以One-way ANOVA进行统计分析。P < 0.05被以为具有统计学显耀互异。

欧美伦理片a在线观看 2 闭幕与分析 2.1 M. bovis感染RAW264.7细胞后GBP5抒发量变化

以MOI为10的M. bovis分手感染RAW264.7细胞不同期间点(0、6、24和48 h)或用不同MOI (0、1、10和50)的M. bovis感染24 h后，通过RT-qPCR检测感染后GBP5的mRNA水平。闭幕如图 1所示，感染M. bovis不同期间点或不同MOI的M. bovis后GBP5的抒发量均显著升高，其中，MOI为10感染24 h时抒发量最高。

2.2 M. bovis感染C57BL/6小鼠的脾脏中GBP5抒发量变化

通过RT-qPCR体式检测不同处置组中脾脏组织内GBP5的抒发水平。如图 2A所示，相较于PBS组，GBP5的mRNA水平在感染M. bovis 6周后的小鼠脾脏组织中显耀上调(P < 0.001)。如图 2B和2C的免疫组化闭幕所示，与PBS组比较，M. bovis感染的脾脏组织中GBP5卵白抒发上调。

2.3 GBP5对M. bovis在巨噬细胞中复制的影响

通过Western blotting和RT-qPCR检测GBP5 3条siRNA的侵略后果。如图 3所示，与siCon组比较，siGBP5-186组GBP5的抒发量下调最显耀，因此登第siGBP5-186用于后续的推行。以MOI为10的M. bovis分手感染转染siGBP5和siCon的RAW264.7细胞6、12、24和48 h后，缱绻细胞内的细菌CFU。如图 4所示，与siCon组比较，下调GBP5后细胞内细菌CFU在感染后不同期间均显耀增多。标明在M. bovis感染历程中GBP5可促进巨噬细胞阻拦M. bovis增殖的作用。

2.4 GBP5对M. bovis感染巨噬细胞极化表型的影响

由于下调GBP5抒发后增多了胞内细菌CFU。因此，为进一步探究GBP5是否通过巨噬细胞极化影响M. bovis感染后胞内存活的情况，检测了M. bovis感染后巨噬细胞极化表型的名义标识物。M. bovis (MOI=10)感染下调GBP5的RAW264.7细胞24 h后，通过RT-qPCR检测M1巨噬细胞标识物如iNOS、白介素-1β (interleukin-1beta， IL-1β)、肿瘤坏死因子α (tumour necrosis factor alpha， TNF-α)、IL-6和白细胞分化抗原86 (cluster of differentiation， CD86)，以及M2巨噬细胞标识物如精氨酸酶1 (arginase 1， Arg1)、组织炎症区域分子1 (found in inflammatory zone 1， Fizz1)和甘霖糖受体C1 (mannose receptor 1， Mrc1)的mRNA水平，通过Western blotting检测M1巨噬细胞标识物iNOS、TNF-α和M2巨噬细胞标识物Mrc1、Arg1的卵白水平。通过流式细胞术检测M1巨噬细胞名义标识物CD86和M2巨噬细胞名义标识物CD206的阳性细胞比例。如图 5A所示，RT-qPCR闭幕标明，下调GBP5抒发后，iNOS、TNF-α、IL-1β、CD86和IL-6的mRNA抒发水平显耀下调(P < 0.01)，而Arg1、Mrc1、fizz1的抒发量增多，无显耀性互异。如图 5B所示，Western blotting闭幕标明，下调GBP5后，iNOS和TNF-α卵白水平显耀下跌(P < 0.01)，而Mrc1、Arg1的卵白水平增多。通过流式细胞术检测CD86和CD206阳性细胞比例发现，与对照组比较，下调GBP5抒发后下调了CD86阳性细胞比例(P < 0.01)，而对CD206阳性细胞无显耀影响。以上闭幕标明下调GBP5后阻拦了M. bovis感染后的RAW264.7细胞向M1型极化，但是对M2巨噬细胞极化无显耀影响，GBP5主要促进M1巨噬细胞极化，从而阻拦M. bovis在细胞内的存活。

2.5 GBP5对M. bovis感染巨噬细胞内ROS开释的影响

为揭示GBP5对M. bovis感染巨噬细胞后ROS开释的调控作用，以MOI为10的M. bovis分手感染转染siGBP5和siCon的RAW264.7细胞24 h后，检测ROS的开释水平。如图 6所示，与siCon+M. bovis组比较，siGBP5+M. bovis组ROS水平在感染24 h后显耀缩小(P < 0.01)，标明下调GBP5后大致阻拦ROS的开释，GBP5在M. bovis感染的历程中可促进ROS的开释。

2.6 GBP5参与调控STAT3转录的启动子

STAT3在巨噬细胞极化中阐述着要紧作用，一些探讨发现IL-6/STAT3、TLR4/NF-κB/STAT3等通路影响巨噬细胞极化[24-25]。因此，咱们推测GBP5可能通过STAT3影响巨噬细胞极化。通过对GBP5和STAT3启动子聚积位点估量，如表 3所示，GBP5可能对STAT3的转录启动子具有调控作用。最终通过双荧光素酶检测解泄气现，与siCon组比较，siGBP5组的双荧光素酶活性相对值缩小(P < 0.05，图 7)，标明STAT3启动子的转录被阻拦，GBP5对STAT3的转录启动存在正调控作用。

2.7 ROS的产生影响STAT3磷酸化

有探讨报说念白屈黄碱栽种细胞ROS水平，导致内质网应激，使STAT3失活[26]。况兼GBP5促进ROS的开释，因此咱们计算ROS参与STAT3的磷酸化历程。用ROS阻拦剂NAC (浓度为0、12.5、25、50、100和200 mmol/L)处置RAW264.7细胞1 h后，检测ROS的开释量，发现12.5 mmol/L的NAC处置后ROS的开释量显耀缩小，如图 8A所示。Western blotting检测解泄气现，在NAC的作用下STAT3的磷酸化(p-STAT3)被激活，标明阻拦ROS大致促进STAT3磷酸化(图 8B)。

3 盘问与论断

GBPs以在病原体与宿主互相作用历程中参与宿主保护性免疫而闻名[27]，GBPs眷属的每个成员阐述的生物学功能并不换取。GBP5在介导细胞自主留心细胞内病原体方面具有新式作用，GBP5通过减少细胞交融阻拦泰国伯克霍尔德菌(Burkholderia thailandensis)复制，从而成心于骨髓起首的巨噬细胞和小鼠叛逆细菌感染[28]。同期，GBP5促进宿主留心鼠伤寒梵衲氏菌的感染[29]。这些探讨标明GBP5有着要紧的抑菌作用，但GBP5对M. bovis感染作用的探讨却鲜有报说念。在本探讨中，咱们通过转录组数据筛选出互异基因GBP5，用M. bovis感染C57BL/6小鼠和RAW264.7细胞，考据了GBP5在M. bovis感染后显耀增多。下调GBP5的抒发后，细胞内M. bovis的CFU增多，这与已有探讨[28-29]中报说念的GBP5阻拦鼠伤寒梵衲氏菌、泰国伯克霍尔德菌感染的闭幕一致，阐发GBP5阻拦细胞内M. bovis的存活。

在M. bovis感染历程中，M1型巨噬细胞相同被以为是有用的效应细胞，可分泌宽广促炎细胞因子，具有要紧的抗菌作用和肿瘤杀伤身手[30]。在M. bovis的急性炎症响应期间，巨噬细胞相同在Th1型免疫轻率中产生的PRR和IFN-γ的作用下极化为M1型，并阐述有用的抗菌作用[31]。咱们的探讨也讲解了这一丝，在M. bovis感染时，M1型巨噬细胞名义标识物增多，而下调GBP5时，M. bovis感染后M1型巨噬细胞名义标识物抒发显耀下调，这些闭幕标明GBP5通过促进巨噬细胞向M1型极化增强其断根胞内M. bovis身手。

炎症响应是宿主先天免疫系统针对无益刺激的一种进化保守的保护响应[32]，对于扬弃结核分枝杆菌感染起着至关要紧的作用，在结核分枝杆菌感染初期，炎症环境更成心于结核分枝杆菌的扬弃[33]。据报说念，ROS大致损害溶酶体并阻断巨噬细胞中的自噬通量，促进巨噬细胞向M1表型极化，从而促进炎症响应[34]。在本探讨中，咱们发现下调GBP5抒发后可减少ROS的开释，是以GBP5可能促进ROS的开释来进一步促进M1表型极化，从而促进炎症响应，扬弃牛分枝杆菌。现在，巨噬细胞极化触及的信号通路主要包括JAK/STAT通路、侵略素周折因子(interferon regulatory factors， IRFs)通路、PI3K/Akt通路、Notch信号通路等，还有一些调控巨噬细胞极化的要道转录因子如NF-κB、AP-1、PPAR-γ等[35-36]。STAT3是信号转导和转录眷属激活因子的成员，通过扬弃细菌助长和阻拦细胞凋一火参与宿主对细菌感染的免疫历程，STAT3通路已被讲解在脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)、INF-γ和其他细胞因子触发的炎症信号级联响应中起着中枢作用，在幽门螺杆菌、梵衲氏菌、结核分枝杆菌等细菌感染历程中阐述要紧作用[37]。通过对GBP5和STAT3启动子的聚积位点进行估量，双荧光素酶敷陈基因系统检测STAT3。闭幕标明，下调GBP5后可阻拦STAT3转录因子启动子的激活，标明GBP5对STAT3转录的启动有正调控作用。有探讨报说念，Nox2通过提示线粒体活性氧的产生来阻拦细胞核中的STAT3的磷酸化[38]。咱们通过NAC阻拦细胞内ROS的开释，讲解了阻拦ROS大致促进STAT3的磷酸化。因此，计算GBP5可能通过ROS/STAT3通路促进M. bovis感染后的巨噬细胞M1型极化，增强巨噬细胞的杀菌身手。关联词，GBP5具体怎么调控ROS/STAT3通路还有待进一步的探讨。

总而言之插入系列，本探讨初步探讨GBP5在叛逆M. bovis感染中参与宿主巨噬细胞的细胞内免疫轻率的作用，揭示了GBP5在M. bovis感染历程中通过促进ROS开释介导ROS/STAT3路子，从而促进M1巨噬细胞极化，阻拦M. bovis在细胞胞内的增殖。这为后续进一步深刻探讨GBP5的抗感染机制奠定了基础，同期也为靶向M. bovis感染的药物筛查和调养提供了新念念路。