副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种嗜盐革兰氏阴性菌，平日散播于讲理的海洋和河口环境中[1]，是世规模制内进击的食源性致病菌。1950年，Fujino博士在日本初度发现该菌引起东说念主类感染，并于1960年发扬定名为副溶血弧菌[2]。东说念主类常通过食用浑浊的海家具而感染该菌初中萝莉液液酱，出现水样泻肚、腹部绞痛和吐逆等典型胃肠炎症状，严重者可激勉较高致死率的败血症[3]。研究标明，得到pVA质粒的致病性副溶血弧菌可引起对虾急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease，AHPND)，严重危害公共水产繁衍业[4]。

副溶血弧菌致病株的基因组序列证据，存在耐热径直溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)和两套Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system，T3SS)等进击毒力因子[5]。以耶尔森氏菌(Yersinia)为代表的革兰氏阴性菌通过Ⅲ型分泌系统将效应卵白注入宿主细胞，罢了遮蔽真核宿主免疫反映的策画[6]。据报说念，T3SS1通过招引自噬、细胞圆化和细胞裂解等多方面参与细胞毒性[7]，而T3SS2在家兔回肠轮回模子中参与肠毒性[8]。T3SS安设是一个高度保守的多卵白复合体，主要由基体、针状结构和针尖复合体构成，与鞭毛组分之间存在序列不异性[9-10]。生物信息预计发现，副溶血弧菌vcrV基因编码的卵白VcrV与耶尔森氏菌LcrV﹑铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PcrV仁爱单胞菌(Aeromonas) AcrV等具有同源性[11-13]。研究标明，耶尔森氏菌LcrV与毒力干系，可行为违犯鼠疫保护性抗原[14]。Mueller等[15]利用扫描透射电子显微镜解说LcrV在针状复合体的顶端造成五聚体的帽子结构。LcrV具有正向调理耶尔森氏菌T3SS效应卵白(Yersinia outer proteins，Yops)分泌的作用，其伴侣卵白LcrG是负向调理因子，可径直梗概转折阻断Yops分泌，二者相互作用共同调控Yops分泌[16]。转运卵白YopB与YopD在宿主细胞膜上造成孔，与LcrV共同完收效应卵白的易位[17]。现在VcrV在副溶血弧菌Ⅲ型分泌系统功能方面的作用有待进一步研究。

本研究中式vcrV基因进行深远探索，以缺失株POR-1行为基础菌株，利用同源重组时刻构建vcrV基因缺失株和回补株，磋议其在副溶血弧菌滋长性能、生物被膜造成才调、细胞黏歌唱细胞毒性等生物学特色的作用，同期考证其对效应卵白分泌与易位的影响，以期对完善副溶血弧菌T3SS1胞外针状复合体的拼装机制具有进击意旨。

1 材料与措施 1.1 菌株、细胞株和质粒

副溶血弧菌参考菌株RIMD2210633、tdhA/S颓势菌株POR-1、Escherichia coli SM10λpir和质粒pMMB207、pYAK1及HeLa细胞由本实验室保存。

1.2 主要试剂和仪器

PrimeSTAR HS (Premix)、TB Green® Premix Ex Taq、禁止性内切酶，TaKaRa公司；ClonExpress® Ⅱ One Step Cloning Kit、HiScript®Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR，南京诺唯赞生物科技股份有限公司；细菌质粒索求试剂盒、细菌总RNA索求试剂盒和胶回收试剂盒，Omega公司；DMEM培养基和胎牛血清，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒，碧云天生物时刻有限公司；细胞全卵白索求试剂盒，江苏凯基生物时刻有限公司；CyaA抗体，圣克鲁斯生物时刻有限公司；硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(TCBS)，海博生物时刻有限公司；ECL化学发光液，天能公司。荧光定量PCR仪和细胞培养箱，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；全自动化学发光图像分析系统，天能公司；多功能酶标仪和紫外分光光度计，帝肯(上海)营业有限公司。

1.3 vcrV基因缺失株和回补株的构建

参照Park等[8]的措施，利用同源重组时刻在tdhA/S颓势菌株POR-1基础上构建缺失株ΔvcrV。缺失vcrV基因与耶尔森氏菌lcrV同源功能域(1 174−1 818 bp)，以参考菌株RIMD2210633基因组为模板，用vcrV-1/vcrV-2和vcrV-3/vcrV-4两对引物分别扩增出vcrV上、卑劣同源臂，并利用vcrV-1/vcrV-4引物进行交融PCR。经BamH I酶切，同源重组酶不竭，得到pYAK1-ΔvcrV自尽性质粒。滚动至大肠杆菌SM10感受态细胞，以大肠杆菌SM10为供体菌、以POR-1为受体菌进行接合革新。利用氯霉素抗性TCBS平板筛选阳性克隆，20%蔗糖LB传代，通过vcrV-1/vcrV-4、vcrV-NF/ vcrV-NR和sacB-F/sacB-R引物浮滑缺失告捷的菌株，将该菌株定名为ΔvcrV。

构建回补株的具体措施与缺失株交流。将回补区域内的ATT同义突变为ATA，以分辨回补株与野生株，两者均编码异亮氨酸，回补株定名为CΔvcrV，构建缺失株和回补株所用的引物具体信息见表 1。

1.4 荧光定量PCR (RT-qPCR)浮滑

挑取POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV单菌落于LB培养基中，37 ℃、180 r/min培养过夜，以1:100 (体积比)接种于崭新的LB液体培养基，37 ℃、180 r/min摇床回荡培养至OD600为0.6。使用细菌总RNA索求试剂盒索求总RNA，回转录为cDNA。以DnaK-RT为内参引物，利用vcrV-RT引物按照TB Green® Premix Ex Taq试剂盒讲明书在StepOnePlus Real-Time PCR System进行PCR反映，每个反映相通3次，接受2−∆∆CT法规划vcrV基因相对抒发率[18]，所用引物具体信息见表 2。

1.5 滋长弧线的测定

挑取POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV单菌落于LB培养基中，37 ℃、180 r/min培养过夜，以1:100 (体积比)接种于50 mL LB液体培养基，37 ℃、180 r/min摇床回荡培养13 h，每隔1 h从归拢锥形瓶取3次样，测量每株菌的OD600。

1.6 生物被膜造成才调的测定

将POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV接种于LB培养基中，37 ℃、180 r/min培养至OD600为0.6，按照1:100 (体积比)接种于崭新的2 mL LB液体培养基，取200 µL稀释好的菌液于无菌96孔板中，以LB液体培养基行为空缺对照组，每组作念6个相通，于37 ℃温箱静置培养48 h。培养末端后辞让孔内液体，用无菌1×PBS清洗孔3次，透风橱干燥。每孔用200 µL无水甲醇固定15 min，风干。孔内生物被膜用1%结晶紫溶液染色5 min，辞让染液，用200 µL ddH2O清洗孔3次，风干后用95%酒精溶液熔化孔内生物被膜初中萝莉液液酱，作用30 min，用酶标仪测量波长595 nm处的吸光度。

午夜伦理伦理片在线观 1.7 细胞毒性履行

把柄碧云天乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒讲明书，设立布景空缺对照组、样品对照组、最大酶活性对照组和样品组。37 ℃、180 r/min条目下，将POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV培养至OD600为0.6，无菌1×PBS洗涤2次，取菌悬液感染96孔板培养的细胞，感染复数(multiplicity of infection，MOI)为10:1，每株菌相通6个孔。37 ℃孵育1 h后，将适量LDH开释试剂与最大酶活性对照组细胞样品混匀，在细胞培养箱连续反映1 h。万般品孔分别加入60 µL LDH检测责任液，室温避光孵育30 min，用酶标仪测定OD490数值，把柄细胞毒性或去世率=(样品吸光度−样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度−样品对照孔吸光度)×100%公式规划LDH酶活性。

1.8 细胞黏附履行

HeLa细胞培养于10%胎牛血清DMEM、37 ℃、5% CO2条目下，履行前一天将HeLa细胞以2×104密度接种于24孔板。用崭新LB培养基重悬POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV，37 ℃、180 r/min摇床培养至OD600为0.6，使用无菌1×PBS分别洗涤细菌和细胞2次，取等量的菌悬液感染HeLa细胞，MOI为10:1，每株菌相通2个孔。在细胞培养箱孵育2 h后，用无菌1×PBS洗涤1次，每孔加入1 mL预冷的0.1% TritonX- 100，37 ℃孵育10 min。每孔取100 µL样品用无菌1×PBS进行10倍倍比稀释，每个稀释度取样3次涂布于LB琼脂平板，37 ℃培养过夜跋文录菌落数，哄骗公式黏附率=(黏附细菌数/细菌总额)×100%规划各菌株相对黏附率。

1.9 分泌履行

通过接合革新的面目，使POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV得到大肠杆菌SM10具有的pMMB207-vp1683-CyaA载体，VopR (Vp1683)是副溶血弧菌T3SS1已浮滑的效应卵白。将具有vp1683过抒发载体的POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV接种于5 mL含3% NaCl的LB培养基，37 ℃、180 r/min培养过夜，转接至10 mL LB培养基，使OD600为0.3，连续摇床培养3 h。5 000 r/min离心10 min分别汇注上清和菌体千里淀，上清用0.22 μm滤器除菌，利用30 kDa超滤管浓缩后，将200 µL预冷的1×PBS反复冲洗超滤管底部得到上清样品。菌体用2 mL预冷的1×PBS洗涤3次，取200 µL重悬后的菌悬液行为样品。将上清样品、菌体样品与5×SDS Loading Buffer羼杂，煮沸10 min，进行卵白免疫思绪实验(Western Blot)，一抗用CyaA抗体孵育，接受ECL化学发光液曝显豁色，分泌履行相通3次。

1.10 易位履行

将HeLa细胞以2×105密度接种于6孔板，在10%胎牛血清DMEM、37 ℃、5% CO2条目下培养至80%−90%。使含有vp1683过抒发载体的POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV于37 ℃、180 r/ min摇床培养至OD600为0.6，辞让细菌和细胞的培养基，用无菌1×PBS分别洗涤2次，取菌悬液感染HeLa细胞2 h，MOI为10:1，设立未感染细胞组。感染末端后，接受细胞全卵白索求试剂盒索求HeLa细胞全卵白，添加适量5×SDS Loading Buffer至样品，煮沸10 min，进行卵白免疫思绪实验(Western Blot)，一抗和二抗分别用CyaA抗体和HRP符号山羊抗小鼠IgG抗体孵育，用ECL化学发光液曝光拍照，易位履行相通3次。

1.11 数据分析

通盘履行均进行了3次，应用GraphPad Prism 8.0软件进行绘制，数据用平均值±范例差(mean±SD)暗示，利用t训练比较了POR-1与ΔvcrV在生物被膜、细胞黏附、细胞毒性、荧光定量PCR浮滑等实验数据的各异。卵白免疫思绪实验成果通过Image J软件进行灰度分析。

2 成果与分析 2.1 vcrV基因缺失株及回补株的浮滑成果

如图 1A所示，用vcrV-1/vcrV-4引物对ΔvcrV进行PCR浮滑，以RIMD2210633基因组DNA为阳性对照，ΔvcrV扩增出945 bp大小的片断(泳说念1)，RIMD2210633基因组DNA扩增出1 604 bp大小的片断(泳说念2)。用里面引物对vcrV-NF/vcrV-NR和筛选符号引物对sacB-F/sacB-R进行浮滑，ΔvcrV无扩增条带(泳说念4和泳说念7)，阳性对照均扩增出正确大小片断(泳说念5和泳说念8)，解说ΔvcrV构建告捷。

如图 1B所示，用外部引物vcrV-1/vcrV-4和里面引物vcrV-NF/vcrV-NR对CΔvcrV进行PCR检测，分别扩增出1 604 bp和659 bp大小的片断(泳说念1和泳说念4)，与RIMD2210633范例菌株交流(泳说念2和泳说念5)，用筛选符号引物sacB-F/sacB-R对CΔvcrV进行浮滑，无扩增条带(泳说念7)，解说CΔvcrV构建告捷。

2.2 RT-qPCR检测vcrV基因转录水平的成果

接受vcrV-RT引物对POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV进行荧光定量PCR检测，成果证据POR-1、CΔvcrV策画基因转录正常，ΔvcrV无vcrV基因转录(图 2)，标明vcrV基因缺失株及回补株构建告捷。

2.3 滋长弧线测定成果

POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV等菌株的滋长弧线成果比较证据(图 3)，vcrV基因的缺失不影响副溶血弧菌的滋长性能。

2.4 vcrV基因缺失对生物被膜造成才调的影响成果

接受结晶紫染色法定量检测POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV等菌株的生物被膜造成才调，成果如图 4所示，ΔvcrV的生物被膜造成才调与基础菌株POR-1比拟无显贵各异(P > 0.05)，标明vcrV基因不参与副溶血弧菌生物被膜造成的调控。

2.5 vcrV基因缺失对细胞毒性的影响成果

POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV等菌株对HeLa细胞的细胞毒性成果如图 5所示，ΔvcrV与基础菌株POR-1比拟，细胞毒性极显贵裁减(P < 0.000 1)，回补株的细胞毒性得以归附，标明vcrV基因影响副溶血弧菌T3SS1介导的细胞毒性。

2.6 vcrV基因缺失对细胞黏附的影响成果

POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV等菌株对HeLa细胞的黏附才调如图 6所示，vcrV基因缺失株与基础菌株POR-1比拟，对HeLa细胞的黏附作用各异不显著，标明vcrV基因不影响副溶血弧菌对HeLa细胞的黏附才调。

2.7 vcrV基因缺失对效应卵白分泌的影响成果

POR-1-vp1683-CyaA、ΔvcrV-vp1683-CyaA和CΔvcrV-vp1683-CyaA等菌株上清和菌体千里淀所含Vp1683-CyaA的量如图 7A所示，3株菌分泌Vp1683-CyaA的量旁边，灰度分析成果证据各异不显贵，标明vcrV基因缺失株在含有过抒发载体的条目下不错分泌T3SS1效应卵白VopR (Vp1683)。

2.8 vcrV基因缺失对效应卵白易位的影响成果

POR-1-vp1683-CyaA、ΔvcrV-vp1683-CyaA和CΔvcrV-vp1683-CyaA等菌株侵染HeLa细胞，检测细胞内Vp1683-CyaA的易位量如图 8A所示，与基础菌株POR-1比拟，vcrV基因缺失株侵染HeLa细胞后细胞内Vp1683-CyaA的易位量显贵下落，回补株的该性状得以归附，灰度分析成果证据存在极显贵各异(P < 0.001)，标明vcrV基因的缺失显贵减少副溶血弧菌T3SS1效应卵白VopR (Vp1683)的易位量。

3 征询与论断

副溶血弧菌T3SS1介导的细胞毒性与安设的拼装和效应卵白易位推测，T3SS1安设的拼装是一个纵横交错和高度相助的流程，需要一系列结构卵白相互作用，造成了包括基体、针状结构和针尖复合体在内的主要部分[19]。咱们通过阅读文件发现，vcrV基因编码的卵白VcrV (420AA−607AA)与铜绿假单胞菌PcrV (95AA−294AA)序列不异性为55%[20]，标明VcrV卵白可能是副溶血弧菌T3SS1针尖卵白。本研究以vcrV基因为研究对象构建了缺失株与回补株，并探索其在副溶血弧菌生物学功能和T3SS1效应卵白分泌中的作用。

副溶血弧菌黏附在海鲜、水产繁衍建树、食物加工建树偏激他非生物名义可造成生物膜[21]。生物膜是一种由多糖、卵白质、核酸和脂类等胞外团员物(extracellular polymeric substances，EPS)造成的复杂微生物汇注体，不错保护菌体幸免恶劣环境、抗生素、宿主免疫辞让的侵害[22]。OpaR是副溶血性弧菌密度感应系统(quorum sensing，QS)调控因子，有研究报说念OpaR正调控荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)生成和生物膜造成，负调控T3SS1基因的抒发和群集解析，标明T3SS1基因的抒发与生物膜造成的调控是相背的[23-26]。生物被膜履行成果证据，vcrV基因缺失株的生物被膜造成才调未显贵下落，教唆vcrV基因的抒发不影响副溶血弧菌生物被膜造成流程。黏附是病原菌对宿主细胞有用感染的第一步，参与细胞黏附的毒力因子包括甘雨糖敏锐血凝素(mannose-sensitive hemagglutinin，MSHA)、多价黏附分子7 (multivalent adhesion molecule 7，MAM7)、Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system，T6SS)、荚膜多糖和烯醇化酶[27-31]等。有文件报说念副溶血弧菌T3SS1负调理因子ExsE参与调理细胞黏附[32]，然而T3SS1是否参与调控细胞黏附仍有待进一步的研究解说。细胞黏附履行成果标明初中萝莉液液酱，vcrV基因不参与副溶血弧菌对HeLa细胞的黏附流程。

副溶血弧菌主要毒力因子耐热径直溶血素﹑T3SS1和T3SS2均参与细胞毒性，T3SS2只对Caco-2等部分细胞系产生毒性作用[33]，T3SS1通过向宿主细胞打针效应卵白产生细胞毒性，现在已发现的有VopS﹑VopR﹑VPA0450和VopQ[34-37]等。据报说念耶尔森氏菌lcrV基因缺失株不可将YopE﹑YopH﹑YopM和YopN等效应卵白注入宿主细胞[38]，解说T3SS1结构的齐全性是效应卵白向宿主细胞易位的重大条目。细胞毒性履行成果证据，vcrV基因缺失株对HeLa细胞毒性作用显贵裁减，标明不可正常抒发针尖卵白VcrV将梗阻副溶血弧菌T3SS1安设的拼装，从而影响T3SS1介导的细胞毒性作用。Zhou等[39]报说念了在vp1659 (vcrV)基因缺失的情况下T3SS1效应卵白VopS仍能易位到宿主细胞，关于其是否影响效应卵白的分泌和易位有待深远探索。本研究接受CyaA申诉系统[40]检测效应卵白VopR (Vp1683)是否分泌与易位，将pMMB207-vp1683- CyaA过抒发载体勾通进POR-1、ΔvcrV和CΔvcrV等菌株，招引T3SS1分泌效应卵白，实验成果发现基础菌株、缺失株和回补株之间的VopR分泌各异不显贵，教唆针尖卵白VcrV可能不是效应卵白从菌内分泌的必要结构卵白，利器具有vp1683过抒发载体的各菌株侵染HeLa细胞，履行成果证据vcrV基因的缺失极显贵影响了副溶血弧菌侵染宿主细胞流程中VopR的易位量。

履行成果标明，vcrV基因对副溶血弧菌滋长性能﹑生物被膜造成才调﹑黏附细胞才调等生物学特色无显贵影响，诚然对T3SS1效应卵白VopR分泌影响不显贵，但参与T3SS1介导的细胞毒性，是副溶血弧菌T3SS1向HeLa细胞打针效应卵白VopR的必要条目。本研究不仅为揭示T3SS1胞外针状结构卵白分泌与调控机制提供了表面基础，也可为研发针尖卵白VcrV干系疫苗提供鉴戒。